O melanoma cutâneo é câncer de pele agressivo1,2 com a profundidade de Breslow reconhecida como o critério mais importante para o estadiamento.3,4 A classificação mais recente da Organização Mundial da Saúde para tumores de pele reflete o conhecimento mais atualizado sobre os subtipos de melanoma, incorporando não apenas características microscópicas, mas também características moleculares e potenciais vias de carcinogênese.5 Nessa classificação, os melanomas cutâneos acrais (MCA) são considerados um grupo distinto.5 Foi descrito pela primeira vez por Reed em 1976 (apud Kuchelmeister C et al.),6 com maior prevalência em populações africanas e asiáticas e tipicamente encontrado nas palmas das mãos, solas dos pés e leitos ungueais.7,8 Notavelmente, o MCA está associado a piores resultados quando comparado com os outros subtipos de melanoma, mesmo após o ajuste para a espessura do tumor.7

Marcadores imuno‐histoquímicos complementam a análise histopatológica para o diagnóstico e resultados de muitos tipos de câncer. Entretanto, nenhum marcador para melanoma cutâneo foi exigido para protocolos de diagnóstico ou estadiamento.9,10 Evidências de múltiplos estudos indicaram o Ki‐67 como marcador prognóstico no melanoma cutâneo, uma vez que índices elevados de Ki‐67 se correlacionam com resultados desfavoráveis.11–15O Ki‐67 é marcador de proliferação celular, com expressão nuclear nas fases G1, S, G2 e mitótica do ciclo celular, mas está ausente em células G0. Portanto, é ferramenta simples e rápida para avaliar a proliferação tumoral.16 Estudos anteriores demonstraram que o Ki‐67 apresenta padrões distintos de localização nuclear durante os vários estágios do ciclo de proliferação celular.17,18 Ele se localiza na camada pericromossômica no início da mitose, em centenas de focos distintos distribuídos homogeneamente na fase G1 inicial, em um ou dois nucléolos na fase G1 tardia, em grânulos densos maiores por todo o núcleo na fase S e em grânulos e nódulos irregulares no nucleoplasma na fase G2.19,20 Dias et al., em 2021, criaram uma classificação das fases do ciclo celular com base nos padrões nucleares (PN) morfológicos da imuno‐histoquímica (IHQ) do Ki‐67. Com base na análise de tumores epiteliais, eles também encontraram diferenças no padrão de expressão do Ki‐67 entre lesões epiteliais benignas e lesões epiteliais malignas ou pré‐malignas.20

Até o momento, nenhum estudo avaliou o padrão de expressão do Ki‐67 no melanoma cutâneo. Este estudo tem como objetivo analisar a concordância inter‐observador da classificação do padrão de expressão de Ki‐67 em MCA e comparar os diferentes tipos de padrões entre dois grupos de pacientes: aqueles que estão vivos (V) e aqueles que vieram a óbito em decorrência de melanoma (OM).

Este é um estudo piloto retrospectivo e transversal que analisou espécimes de pele fixados em formalina e incluídos em parafina, coletados de MCA avançados, todos classificados no mesmo estágio (pT4),10 de um centro de referência em câncer no Brasil. Os critérios de inclusão foram definidos como casos de MCA invasivo pT4 diagnosticados entre 2008 e 2020, visto que esse estágio está associado aos piores prognósticos. Os critérios de exclusão consistiam em casos com coloração IHQ falha ou subótima, ausência de dados de sobrevida e melanomas ungueais. Para a análise, sete casos por grupo – V e OM – foram selecionados aleatoriamente. Núcleos sobrepostos ou borrados foram excluídos da avaliação. A duração do seguimento dos pacientes foi descrita por grupo em meses.

A Ventana Roche realizou a análise IHQ no sistema de coloração automática Benchmark GX, aplicando o kit UltraView DAB com Ki‐67 (Dako, clone MIB‐1, pré‐diluído). As lâminas de IHQ, seccionadas a 3μm, foram digitalizadas usando o sistema Aperio CS™ (Leica Biosystems, EUA). Uma seção de 1mm quadrado foi demarcada em pontos críticos para exame detalhado de cada amostra. Esse tamanho de área foi escolhido para estar alinhado com a contagem de mitoses da AJCC.10 As lâminas foram avaliadas por dois patologistas, que identificaram independentemente núcleos Ki‐67 positivos dentro da área designada (hotspot), utilizando esquema de círculos coloridos com base na classificação de Dias, da seguinte maneira: círculo azul para NP1 (grânulos finos ou grosseiros imunopositivos para Ki‐67 distribuídos aleatoriamente, correspondendo à fase G1 inicial), círculo verde para NP2 (Ki‐67 presente em um ou dois nódulos bem definidos e centralizados, correspondendo à fase G1 tardia), círculo laranja para NP3 (Ki‐67 observado como grânulos ou nódulos ocupando a maior parte do núcleo, correspondendo à fase S), círculo marrom para NP4 (nucleoplasma com coloração Ki‐67 intensa e homogênea, correspondendo à fase G2) e círculo vermelho para NP5 (área central vazia com Ki‐67 periférico ou exclusivamente nos cromossomos, correspondendo à mitose), conforme mostrado nas figuras 1 e 2. Em seguida, o número de núcleos corados foi contabilizado para cada padrão em todos os casos.

Figura 1.

Exemplos de cada padrão de coloração Ki‐67, com base na classificação de Dias.

Figura 2.

Exemplos da área demarcada de um milímetro quadrado e a classificação dos padrões de coloração de Ki‐67 por meio de círculos coloridos. Um caso do grupo “V” na imagem A e do grupo “OM” na imagem B. Círculo azul: NP1. Círculo verde: NP2. Círculo laranja: NP3. Círculo marrom: NP4. Círculo vermelho: NP5.

Apenas a positividade nuclear foi considerada. A coloração citoplasmática ou membranosa não foi incluída. Ambos os patologistas analisaram exatamente a mesma área, mas os núcleos a serem contados não foram previamente marcados. Eles foram previamente treinados usando cinco amostras de tecido epitelial obtidas dos arquivos do grupo de pesquisa. Para avaliar a concordância entre as medidas, foi realizada análise gráfica de Bland‐Altman para calcular o viés entre as medidas, o coeficiente de correlação de concordância de Lin e o gráfico correspondente. As medidas de desfecho foram correlacionadas com os dados de sobrevida extraídos dos registros eletrônicos de saúde, levando à categorização dos casos em dois grupos: aqueles que estavam vivos e aqueles que vieram a óbito em decorrência do melanoma.

Essa análise foi realizada utilizando o software STATA para Windows, versão 21. Foi calculada a média dos dados de cada avaliador. Foi realizada comparação das médias para cada padrão de coloração nuclear, utilizando ajuste de distribuição binomial negativa.

O limiar de significância de 5% ou o valor de p correspondente foi estabelecido para todos os testes. As análises foram conduzidas utilizando o SAS para Windows versão 9.4. e SPSS para Windows versão 21. Para avaliar o risco de viés, foi aplicada a ferramenta Study Quality Assessment Tool for Cross‐Sectional Diagnostic Pathology Studies (SQAT‐Path),21 adaptada da escala modificada de Newcastle‐Ottawa.

Esta pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CAAE 52618721.0.1001.5411 e CAAE 52618721.0.3001.5434).

Nesta análise, um total de 5.676 núcleos Ki‐67 positivos de 14 casos foram avaliados, com sete casos no grupo V e sete casos no grupo OM. Em ambos os grupos, quatro casos (57,15%) eram do sexo masculino, enquanto três casos (42,86%) eram do sexo feminino. A média de idade do grupo V foi de 65 anos, enquanto no grupo OM a média de idade foi de 74 anos. Em relação à espessura de Breslow, a média no grupo V foi de 7,2mm (DP=1,6; mediana: 7,4mm; intervalo: 4,3–9,3), enquanto no grupo OM a média foi de 9,1mm (DP=2,08; mediana: 8,1mm; intervalo: 7–13). O grupo V apresentou tempo médio de seguimento de 52 meses, enquanto o grupo OM demonstrou sobrevida média de 31 meses após o diagnóstico. Considerando a aplicação da contagem digital de células com base no padrão de coloração Ki‐67 no hot spot, os pacientes do grupo V apresentaram um total de 1.689 núcleos Ki‐67 positivos, em contraste com o grupo OM, que apresentou um total de 3.987 núcleos positivos (tabela 1). Além disso, observou‐se diferença significante no número total de núcleos positivos (p=0,0258), com o grupo V apresentando média de 241,21 (DP=184,47, intervalo: 51–493,5) e o grupo OM apresentando média de 569,57 (DP=258,45, intervalo: 130–855; tabela 2). O coeficiente de correlação de concordância de Lin foi de 0,9783, refletindo nível substancial de concordância entre os patologistas.22 A análise de Bland‐Altman revelou viés de 6,36 com intervalo de confiança de 95% de−26,61 a 39,32 (DP=57,10), como mostrado na figura 3.

Figura 3.

Gráfico de concordância de Bland‐Altman da análise dos padrões nucleares entre dois grupos (pacientes vivos e pacientes com óbito relacionado a melanoma acral, n=14) realizada por dois patologistas. No eixo das abscissas (X) estão as médias de núcleos positivos de cada caso avaliadas pelos dois patologistas, e no eixo das ordenadas (Y) está a diferença entre as contagens de núcleos positivos.

Uma análise comparativa das médias entre os dois grupos revelou diferenças estatisticamente significantes nos padrões de coloração nuclear NP1 (p=0,0014), NP4 (p=0,038) e NP5 (p=0,0193). Especificamente, o grupo V apresentou média de 50 núcleos classificados como NP1 (DP=30,68, intervalo: 18–98). O grupo OM apresentou média de NP1 de 164 (DP=71,56, intervalo: 31–241). Para o padrão NP4, a média do grupo V foi de 16 núcleos (DP=30,74; intervalo: 2–85,5), enquanto o grupo OM apresentou média de NP4 de 56,14 (DP=51,72; intervalo: 25–170). Quanto ao NP5, a média do grupo V foi de 3,86 (DP=5,01; intervalo: 1–15), em comparação com o grupo OM, que apresentou média de NP5 de 14,86 (DP=15,08; intervalo: 1–45). Não foram encontradas diferenças significantes para os padrões NP2 e NP3 (p=0,4322 e p=0,051, respectivamente).

A presente análise destaca a possível relevância dos padrões de coloração de Ki‐67 como indicador prognóstico em casos avançados de MCA. O coeficiente de correlação de concordância de Lin foi alto, alinhados com Dias et al., que mostraram concordância inter‐observador diagnóstica moderada em seu estudo (κ=0,523). Diferenças significantes nos padrões de coloração nuclear foram observadas entre os dois grupos analisados. Contagens mais altas de núcleos Ki‐67 positivos foram associadas a piores desfechos (óbito), particularmente nos padrões de coloração NP1 (fase G1 inicial), NP4 (fase G2) e NP5 (mitose), o que pode indicar comportamento tumoral mais agressivo. Como esses três padrões estão intimamente relacionados ao processo mitótico (NP4 antes, NP5 durante e NP1 após a mitose), que é biomarcador bem estabelecido de agressividade, os resultados reforçam a aplicabilidade da metodologia proposta e destacam sua relevância em casos de melanoma.

Estudos anteriores mostraram que alta proliferação está associada a pior prognóstico.11–13 De fato, até 2015, a mitose era um critério para estadiamento na sétima edição do AJCC Melanoma Staging.23 O Ki‐67 é parâmetro prognóstico bem estabelecido em pacientes com melanoma,24 e com base nesses dados, sugere‐se que a análise do Ki‐67 possa ter aplicabilidade potencial além da simples estimativa do número de células positivas.

Independentemente do prognóstico, Dias et al. mostraram que, entre as lesões epiteliais malignas ou pré‐malignas, predominavam núcleos NP4, enquanto entre as lesões benignas predominavam núcleos NP1 e NP2.20 No presente estudo, no entanto, não foi encontrado padrão predominante em pacientes do grupo V com MCA. Os padrões NP1, NP4 e NP5 foram mais frequentes no grupo OM. Loddo et al. estudaram a progressão das fases do ciclo celular em 182 pacientes com câncer de mama invasivo. Eles descobriram que o aumento do grau tumoral está associado a maior proporção de células envolvidas no ciclo de divisão celular (reguladores G1 – S e G2 – M).23

A maioria das neoplasias apresenta ciclo celular desregulado, em virtude de alterações nos reguladores da função CDK. Além disso, muitos oncogenes contribuem para essa desregulação do ciclo celular.25 A identificação da fase do ciclo celular pode desempenhar papel importante nas estratégias terapêuticas, visto que uma variedade de agentes anticancerígenos, incluindo aqueles usados para melanoma, não apenas afetam o ciclo celular, mas também dependem de fases específicas para serem eficazes. O bortezomibe, por exemplo, induz a parada nas fases G1 e G2 e causa apoptose das células na fase G2.26,27 Os inibidores de CDK4/6 bloqueiam a progressão para fora da fase G1. A gencitabina atua durante a fase S,28 e o flavopiridol atua nas fases G1 e G2, causando parada do ciclo celular e impedindo que as células entrem na fase M. O paclitaxel é mais ativo na fase M.29

Além disso, certos medicamentos têm como alvo células altamente proliferativas com mais eficácia do que aquelas em ciclo lento.26 O presente estudo mostrou que a maioria das células classificadas estava situada antes da mitose, e o tempo necessário para as células atingirem a mitose após a expressão inicial de Ki‐67 pode variar de acordo com a velocidade do ciclo celular. Esse achado pode explicar a possível falha de medicamentos mais ativos na fase M. Também pode corroborar a ideia de que a contagem mitótica é parâmetro subótimo para prever resultados. Considerando a importância do ciclo celular e a ação dos medicamentos sobre ele, a classificação dos padrões nucleares de Ki‐67 para determinar a fase das células tumorais poderia fornecer um plano de relatório personalizado para o paciente, orientando a conduta dos oncologistas e abrindo novas possibilidades para a otimização do tratamento. No entanto, são necessários mais estudos para padronizar os procedimentos, estabelecer protocolos clínicos e avaliar a aplicabilidade da inteligência artificial nesse contexto.

Estudos anteriores estabeleceram o Ki‐67 como marcador prognóstico no melanoma cutâneo, mas até agora, nenhum estudo investigou e comparou os padrões de coloração específicos. O presente estudo apresenta algumas limitações. Um número limitado de casos foi avaliado (embora um total de 5.676 núcleos seja notável), e o estudo foi restrito ao subtipo MCA em estágio avançado identificado em uma única instituição. O valor de viés de 6,35 em relação à análise dos observadores foi notável, embora o coeficiente de correlação de concordância de Lin tenha indicado alto nível de concordância. O alto viés pode ser atribuído à subjetividade interpessoal na avaliação do padrão. Além disso, a ausência de pré‐seleção de núcleos para análise pode contribuir para a variabilidade, embora tenha tornado as análises mais próximas do cenário da prática rotineira (mundo real). No entanto, quando avaliado com o SQAT‐Path21, o estudo demonstrou baixo risco de viés.

Esses achados destacaram a aplicabilidade dos padrões de coloração nuclear de Ki‐67 para prever resultados entre casos avançados de MCA. Mais estudos com casos mais significantes são necessários para elucidar as diferenças nos padrões de coloração de Ki‐67 em vários tipos de câncer cutâneo, sua correlação com os resultados dos pacientes e a resposta à quimioterapia; e para comparar esses achados com medidas existentes de prognóstico de melanoma, como o índice mitótico. Esses resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de algoritmos computacionais que auxiliem os patologistas na análise do prognóstico do MCA de modo mais abrangente do que simplesmente estimando a porcentagem de células Ki‐67 positivas.

Marcel Arakaki Asato: 0000‐0002‐6050‐5292

Isabeli Joaquim Contel: 0000‐0001‐6943‐338X

Francisco Alves Moares Neto: 0009‐0001‐7820‐8106

Juliana Polizel Ocanha‐Xavier: 0000‐0002‐1200‐3730

Nathália Silva Carlos Oliveira: 0000‐0003‐3733‐0022

Maxwell A. Fung: 0000‐0003‐1771‐8257

Mariangela Esther Alencar Marques: 0000‐0001‐6947‐5627

Os Comitês de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina – UNESP/Botucatu – SP (CAAE 52618721.0.1001.5411) e do Hospital Amaral Carvalho (CAAE 52618721.0.3001.5434) aprovaram o estudo. Consentimento do paciente não aplicável.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brasil. O financiador não teve qualquer papel no desenho do estudo, obtenção de dados, análise de dados e relatório deste estudo.

Marcel Arakaki Asato: Investigação; curadoria de dados; análise formal; redação do texto original.

Isabeli Joaquim Contel: Investigação; curadoria de dados; análise formal; redação – revisão e edição.

Nathália Silva Carlos Oliveira: Conceitualização; revisão e edição.

Francisco Alves Moares Neto: Análises formais e revisão e edição.

Mariangela Esther Alencar Marques: Revisão e edição.

Juliana Polizel Ocanha‐Xavier: Conceitualização; revisão e edição.

Maxwell A. Fung: Redação – revisão e edição.

José Cândido Caldeira Xavier‐Júnior: Conceitualização; metodologia; investigação; redação – revisão e edição; supervisão.

Todo o conjunto de dados que dá suporte aos resultados deste estudo foi publicado no próprio artigo.

Nenhum.

Sílvio Alencar Marques