O penfigoide das membranas mucosas (PMM) é doença bolhosa autoimune com manifestações clínicas heterogêneas e de difícil diagnóstico. A imunofluorescência direta (IFD) é fundamental, mas seu papel em abordagens multimodais ainda não está claro.
ObjetivoAvaliar o desempenho diagnóstico da IFD no PMM e explorar os fatores que afetam seus padrões de positividade em fluxos de trabalho multimodais.
MétodosForam analisados retrospectivamente 79 pacientes com suspeita de PMM, categorizando‐os em grupos confirmados e não confirmados com base em critérios clínicos, histopatológicos e sorológicos. A IFD de biopsias mucosas perilesionais mostrou depósitos lineares de IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogênio ao longo da zona da membrana basal (ZMB). A eficácia diagnóstica foi avaliada por análise da curva ROC.
ResultadosForam confirmados 55 casos. A histopatologia demonstrou bolhas subepiteliais em 51, com especificidade de 100% e sensibilidade de 92,73% (AUC=0,964, p <0,05). A IFD identificou 47 casos; C3 (63,64%) e IgG (60,00%) foram os mais comuns, apresentando sensibilidade de 85,45%, especificidade de 100% e concordância de 97,87% com a histopatologia. A duração da doença foi um preditor independente de IgM positiva (p=0,023).
Limitações do estudoEste estudo é um estudo retrospectivo de centro único com uma amostra de tamanho limitado, o que apresenta certas limitações.
ConclusãoA IFD, com especificidade de 100%, auxilia a histopatologia no diagnóstico do PMM, especialmente na presença de deposição linear de C3/IgG na ZMB. Notavelmente, a positividade para IgM correlaciona‐se com a duração da doença antes da biopsia, sugerindo que a eficiência da IFD pode estar relacionada ao estágio da doença.
O penfigoide das membranas mucosas (PMM), doença bolhosa autoimune crônica que afeta a zona da membrana basal (ZMB), apresenta desafios diagnósticos significantes em virtude de suas apresentações clínicas heterogêneas e características sobrepostas com outras doenças mucocutâneas.1–3 Embora o envolvimento da mucosa oral ocorra em 85% dos casos, as manifestações extramucosas (p. ex., oculares, cutâneas) geralmente surgem posteriormente, dificultando o diagnóstico precoce.4–6 Os critérios diagnósticos atuais enfatizam a abordagem multimodal que integra evidências clínicas, histopatológicas e imunológicas.7–10
A histopatologia continua sendo a base do diagnóstico do PMM, revelando fendas subepiteliais e infiltrados inflamatórios na ZMB.6 No entanto, até 30% das lesões em estágio inicial podem não apresentar bolhas evidentes, reduzindo sua sensibilidade.11 A imunofluorescência direta (IFD) continua sendo o padrão ouro para confirmar o PMM pela detecção de depósitos lineares de IgG, C3, IgA ou fibrinogênio ao longo da ZMB.12–14 Metanálises recentes relatam sensibilidade agrupada da IFD de 73% a 89% em biopsias perilesionais,15,16 com C3 e IgG exibindo as maiores taxas de positividade.17
Apesar de sua utilidade diagnóstica, a interpretação da IFD é dificultada por diversos fatores. A farmacoterapia pré‐biopsia (p. ex., corticosteroides) pode reduzir a deposição de imunorreativos,18 enquanto a atividade da doença e a variabilidade do local da amostragem (p. ex., mucosa lesional versus perilesional) impactam as taxas de positividade.19,20 O debate continua sobre o local ideal para biopsia, com alguns estudos favorecendo a mucosa não lesional,21 e outros apoiando o tecido lesional.22
Os testes sorológicos para anti‐BP180/BP230 usando ELISA mostram alta especificidade (> 90%), mas baixa sensibilidade (< 50%) em PMM,23 limitando seu uso como ferramenta isolada,24 Diretrizes recentes recomendam, portanto, algoritmos combinados que integrem IFD, histopatologia e sorologia para melhorar a precisão diagnóstica.6,25
O presente estudo aborda lacunas críticas no diagnóstico de PMM por meio de: 1) avaliação sistemática do desempenho da IFD em estrutura multimodal; 2) quantificação do impacto da farmacoterapia pré‐biopsia e da atividade da doença na positividade da IFD; 3) proposição de algoritmo diagnóstico padronizado para otimizar a utilidade da IFD na prática clínica.
MétodosParticipantesSetenta e nove pacientes com suspeita de PMM, que realizaram o teste de IFD no Departamento de Patologia Oral do Peking University Hospital of Stomatology entre janeiro de 2023 e dezembro de 2024, foram retrospectivamente incluídos neste estudo. Critérios de inclusão: 1) manifestações clínicas sugestivas de PMM (p. ex., bolhas/erosões na mucosa oral); 2) disponibilidade de dados clínicos, histopatológicos e de IFD completos. Critérios de exclusão: 1) prontuários médicos incompletos; 2) outras doenças da mucosa oral concomitantes. Para pacientes com múltiplas consultas, foram analisados apenas os dados da primeira consulta. Amostras de controle (n=24) foram obtidas de pacientes inicialmente com suspeita de PMM, mas excluídos após avaliação abrangente, conforme descrito a seguir. Biopsias foram coletadas da mucosa oral perilesional utilizando o mesmo protocolo dos casos confirmados.
Critérios diagnósticos- 1.
Manifestações clínicas suspeitas de PMM: as membranas mucosas orais frequentemente apresentam bolhas e erosões, envolvendo mais comumente a gengiva e a mucosa palatina. As lesões gengivais são frequentemente descritas como gengivite descamativa. Além disso, as lesões podem afetar a conjuntiva, a faringe, o sistema reprodutivo e a pele, apresentando eritema, bolhas e cicatrizes.
- 2.
Achados microscópicos positivos: as imagens histopatológicas mostram clivagem subepitelial, acompanhada por infiltração mista não específica composta por linfócitos, histiócitos, plasmócitos, neutrófilos e eosinófilos.
- 3.
Teste sorológico positivo para anticorpos: positivo para BP180/BP230 detectado por ELISA.
De acordo com as diretrizes S3 para o diagnóstico de PMM,6 o teste de anticorpos deve ser realizado em indivíduos com manifestações clínicas suspeitas de PMM. Aqueles com anticorpos sorológicos positivos são classificados no grupo PMM confirmado. Para indivíduos com resultados negativos no exame sorológico, se os achados microscópicos forem positivos, eles são classificados no grupo confirmado; caso contrário, são classificados no grupo não confirmado.
Processamento das amostrasAmostras de biopsia foram enviadas ao laboratório de patologia interno, incluídas em composto OCT e congeladas rapidamente. Cortes seriados de 5μm de espessura foram obtidos utilizando um criostato. Uma seção foi corada com hematoxilina e eosina (H&E) para confirmação histopatológica da presença de lesões epiteliais. Seções consecutivas de casos confirmados foram utilizadas para análise de IFD.
Imunofluorescência diretaAnticorpos primários contra IgG, IgM, IgA, fibrinogênio e C3 (todos adquiridos comercialmente, diluídos de acordo com as instruções do fabricante) foram aplicados em seções separadas. Após incubação a 37°C por 30 minutos, os anticorpos não ligados foram removidos com três lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS, do inglês phosphate‐buffered saline). Em seguida, foram aplicados anticorpos secundários conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), e as seções foram incubadas no escuro a 37°C durante mais 30 minutos. Após lavagens finais com PBS, as seções foram montadas com meio de montagem antifade e visualizadas em microscópio de fluorescência.
Os resultados da IFD foram interpretados por dois patologistas experientes, que desconheciam os dados clínicos, seguindo critérios estabelecidos:
IFD positiva: autoanticorpos (IgG, componente C3 do complemento, IgM, IgA e fibrinogênio) depositam‐se linearmente ao longo da ZMB, visualizados como fluorescência verde linear contínua.
IFD negativa: ausência de fluorescência linear na ZMB.
Coloração não específica: a IFD revelou fluorescência verde pontilhada/granular descontínua ou linear contínua focal ao longo da ZMB.
Detecção por ELISAAmostras de soro foram coletadas no momento da biopsia. Os anticorpos anti‐BP180 (domínio NC16A) e anti‐BP230 foram quantificados utilizando kits ELISA (MBL International) seguindo as instruções do fabricante. O limiar ≥ 20 U/mL foi definido como positivo.
Métricas de eficiência diagnóstica- 1.
Sensibilidade=(Número de verdadeiros positivos pelo método diagnóstico/Número de positivos pelo padrão ouro)×100%
- 2.
Especificidade=(Número de verdadeiros negativos pelo método diagnóstico/Número de negativos pelo padrão ouro)×100%
- 3.
Taxa de concordância geral=[(Verdadeiros positivos+Verdadeiros negativos)/Total de casos]×100%
- 4.
Valor preditivo positivo (VPP)=(Verdadeiros positivos/Total de positivos pelo método diagnóstico)×100%
- 5.
Valor preditivo negativo (VPN)=(Verdadeiros negativos/Total de negativos pelo método diagnóstico)×100%
- 6.
Taxa de diagnósticos perdidos=(Falsos negativos/Positivos pelo padrão ouro)×100%
- 7.
Taxa de diagnósticos incorretos=(Falsos positivos/Negativos pelo padrão ouro)×100%
A análise foi realizada utilizando o SPSS 24. As variáveis contínuas com distribuição normal e variância homogênea foram apresentadas como média± desvio padrão (DP) e comparadas utilizando o teste t de Student para amostras independentes. Os dados com distribuição não normal foram apresentados como mediana e analisados pelo teste U de Mann‐Whitney. Os dados categóricos foram expressos em porcentagens (%) e comparados utilizando o teste Qui‐Quadrado de Pearson (χ2) ou o teste exato de Fisher quando o tamanho da amostra era pequeno. O desempenho diagnóstico dos achados clínicos, histopatológicos e de IFD para PMM foi avaliado utilizando a análise da curva ROC (receiver operating characteristic), calculando a área sob a curva (AUC), a sensibilidade e a especificidade. Um valor de p bicaudal <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
ResultadosCaracterísticas dos pacientes e sorologiaForam incluídos 79 pacientes (22 homens, 57 mulheres; média de idade de 58,57±11,74 anos). Dentre eles, 55 pacientes (17 homens, 38 mulheres; média de idade de 61,36±10,93 anos) receberam diagnóstico definitivo de PMM. A mucosa oral foi o local predominante de envolvimento (gengiva em 64,56%), com 61,82% dos casos relatando histórico de bolhas. A duração da doença variou de 0,7 a 240 meses (mediana de 20,92 meses). No grupo PMM, o histórico de medicação pré‐biopsia foi documentado em 61,82% dos pacientes, com corticosteroides tópicos.
O ELISA para BP180/BP230 mostrou utilidade limitada: apenas 22/55 pacientes com PMM (40,00%) apresentaram resultado positivo para BP180 e 6/55 (10,91%) para BP230.
HistopatologiaO exame histopatológico revelou bolhas subepiteliais em 51/55 participantes com PMM e em 0/24 controles, demonstrando sensibilidade de 92,73%, especificidade de 100% e taxa de concordância diagnóstica de 94,94% (fig. 1).
Características histopatológicas representativas do PMM sob microscopia óptica. Separação epitelial da lâmina própria com denudação parcial. A superfície do tecido conjuntivo denudado apresenta‐se lisa, acompanhada pela formação de bolhas subepiteliais. A lâmina própria demonstra infiltração de linfócitos, plasmócitos e eosinófilos.
Nos dados do presente estudo, o padrão clássico de fluorescência da IFD tipicamente se apresenta como depósito linear verde, contínuo e homogêneo, ao longo da junção epitelio‐conjuntiva (fig. 2). A análise por IFD revelou deposição de imunorreativos na ZMB em 47/55 participantes com PMM e em 0/24 controles. Entre os casos positivos para IFD, 91,49% exibiram coloração linear homogênea típica ao longo da ZMB, enquanto padrões de fluorescência linear ou granular regionais foram observados em 8,51% desses casos.
Notavelmente, C3 e IgG demonstraram as maiores taxas de positividade (65,45% e 60,00%, respectivamente) entre os casos positivos para IFD. A codeposição de C3 e IgG foi observada em 45,45% dos casos, enquanto a positividade isolada para C3 ou IgG ocorreu em 20,00% e 14,55%, respectivamente. Fibrinogênio, IgA e IgM apresentaram taxas de positividade abaixo de 50%, com IgM exibindo envolvimento mínimo (< 10%).
A eficácia diagnóstica da IFD está resumida na tabela 1, com sensibilidade de 85,45%, especificidade de até 100% e índice de Youden de 0,8545. A AUC da IFD é 0,927 (IC 95% 0,869–0,985, p <0,001) (fig. 3).
Eficácia diagnóstica de diferentes indicadores de imunofluorescência direta
| Índice de exame | Sensibilidade | Especificidade | Taxa de concordância | Valor preditivo positivo | Valor preditivo negativo | Taxa de diagnósticos perdidos | Taxa de diagnósticos incorretos |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IgG | 60,00% | 41,67% | 54,43% | 70,21% | 31,25% | 40,00% | 58,33% |
| C3 | 65,45% | 66,67% | 65,82% | 81,82% | 45,71% | 34,55% | 33,33% |
| Fibrinogênio | 45,45% | 83,33% | 56,96% | 86,21% | 40,00% | 54,55% | 16,67% |
| IgA | 21,82% | 95,83% | 44,30% | 92,31% | 34,85% | 78,18% | 4,17% |
| IgM | 7,27% | 95,83% | 34,18% | 80,00% | 31,08% | 92,73% | 4,17% |
| Imunofluorescência direta | 85,45% | 100,00% | 89,87% | 100,00% | 75,00% | 14,55% | 0,00% |
Curva ROC do diagnóstico por imunofluorescência direta (IFD). A curva ROC do diagnóstico por IFD conecta pontos de coordenadas com 1 – especificidade (= taxa de falsos positivos) no eixo x e sensibilidade no eixo y em todos os valores de corte medidos a partir dos resultados do teste. A linha diagonal de 45° serve como linha de referência, pois representa a curva ROC de classificação aleatória.
Na coorte de PMM, 46 dos 47 pacientes com IFD positiva (97,87%) apresentaram bolhas subepiteliais na histopatologia, demonstrando correlação significante entre esses resultados (p <0,001). O único caso discordante apresentou infiltração de células inflamatórias dispersas na lâmina própria sem formação distinta de bolhas. Esse paciente apresentou erosões orais recorrentes na mucosa jugal bilateral e no dorso da língua, corroboradas por testes positivos para autoanticorpos (tanto sorológicos quanto por IFD), confirmando, em última instância, o diagnóstico de PMM.
A análise dos potenciais fatores que influenciam as taxas de positividade na IFD revelou correlação positiva significante entre a duração da doença e a positividade para IgM (p=0,023), mas não mostrou correlações significantes com IgG (p=0,256), IgA (p=0,607), C3 (p=0,541) ou fibrinogênio (p=0,256). Maior duração da doença correlacionou‐se com a deposição de IgM na ZMB (duração mediana: 24 meses em casos IgM (+) vs. três meses em casos IgM (–); p=0,023).
Entre 55 casos confirmados, oito pacientes apresentaram resultado negativo para IFD. As manifestações clínicas, características histopatológicas e resultados dos testes sorológicos desses pacientes são apresentados na tabela 2. Os resultados negativos para IFD não mostraram correlação significante com a localização das lesões, histórico de bolhas, lesões cutâneas, histórico de medicação pré‐operatória ou duração da doença (p >0,05).
Outros resultados de testes de pacientes com imunofluorescência direta negativa no grupo PMM
| N° | Manifestações clínicas | Características histopatológicas | Resultados dos testes sorológicos |
|---|---|---|---|
| 1 | Presença recorrente de bolhas e erosões na gengiva posterior direita por um a dois anos | Bolhas subepiteliais | BP180(+)/BP230(+) |
| 2 | Ulcerações e erosões gengivais recorrentes há mais de um ano, com histórico de formação de bolhas | Bolhas subepiteliais | BP180(–)/BP230(–) |
| 3 | Ulcerações e erosões recorrentes na gengiva vestibular dos dentes 24‐25 nos últimos dois meses, com histórico de formação de bolhas | Bolhas subepiteliais | BP180(+)/BP230(–) |
| 4 | Úlceras gengivais por três a quatro anos | Bolhas subepiteliais | BP180(–)/BP230(+) |
| 5 | Úlceras gengivais recorrentes por mais de seis meses | Bolhas subepiteliais | BP180(–)/BP230(–) |
| 6 | Dor recorrente e ulceração em ambas as regiões bucinadoras, lábios e língua há mais de seis anos, acompanhadas de lesões cutâneas no abdome e na parte inferior das pernas | Inflamação da mucosa, sem formação evidente de bolhas subepiteliais | BP180(+)/BP230(+) |
| 7 | Úlceras bucais recorrentes por três meses | Ulceração da mucosa com inflamação, sem formação evidente de bolhas subepiteliais | BP180(+)/BP230(+) |
| 8 | Ulceração bucal direita há mais de dois meses, com úlceras visíveis na região faríngea | Ulceração da mucosa com inflamação, sem formação evidente de bolhas subepiteliais | BP180(+)/BP230(–) |
PMM é doença autoimune bolhosa que afeta principalmente a mucosa e a pele. Os dados demográficos da presente coorte estão de acordo com a epidemiologia estabelecida do PMM,10,20,26‐29 confirmando sua predileção por mulheres idosas e mucosa oral (gengiva> 80%).29–32 O envolvimento extramucoso (p. ex., ocular, cutâneo) complica ainda mais o diagnóstico precoce.5,30
As diretrizes europeias S3 enfatizam a abordagem multimodal sequencial para o diagnóstico de PMM; o presente estudo reafirma o papel crítico da IFD, servindo como ferramenta diagnóstica complementar vital para PMM.6,25,33,34 Sorologicamente, os anticorpos BP180 são detectados em 46% dos casos de PMM oral, enquanto a reatividade para BP230 ocorre em 0% a 40%.35–39 A histopatologia pode não detectar bolhas subepiteliais em virtude de limitações técnicas. De particular importância é o papel complementar da IFD quando os métodos diagnósticos convencionais apresentam resultados negativos. O desempenho da IFD corrobora metanálises que confirmam seu papel no diagnóstico multimodal,3 Sua especificidade quase perfeita e sinergia com a histopatologia reduzem criticamente os riscos de diagnóstico incorreto:6 ela confirmou PMM em um caso histopatológico negativo e 19 casos sorológicos negativos, excluindo todos os controles não PMM. Isso posiciona a IFD como complemento indispensável aos métodos convencionais em apresentações ambíguas.
Alguns estudos mostraram que a taxa de positividade dos indicadores de IFD é afetada pelo curso da doença.40,41 O presente estudo propõe uma nova correlação: a deposição de IgM prevê duração prolongada da doença (p=0,023), potencialmente refletindo exposição crônica ao antígeno ou troca de isótipo em PMM avançado. Isso contrasta com as respostas dominantes de IgG/C3 nos estágios iniciais, sugerindo o IgM como biomarcador candidato para cronicidade da doença – hipótese que justifica estudos sorológicos longitudinais.
Na presente coorte, apenas oito casos confirmados de PMM apresentaram resultados negativos na IFD, em consonância com as taxas de positividade relatadas na literatura, de 80% a 95%.3,42,43 Os resultados falso‐negativos na IFD decorrem principalmente de cinco categorias:
- (i)
Seleção do local de amostragem: a seleção do local da biopsia impacta significantemente a positividade na IFD, embora os locais ideais para biopsia ainda sejam controversos. As diretrizes atuais recomendam tecido perilesional (0,5 a 1cm ao redor das bolhas/erosões) ou mucosa normal, não afetada quando inacessível.6,44 Embora Carey et al. relatem taxas de positividade equivalentes entre os locais,14 uma metanálise designa a mucosa não afetada como ideal para PMM.16 Além disso, se a amostragem de diferentes locais da mucosa oral (p. ex., gengiva, língua, mucosa jugal) influencia os resultados falso‐negativos na IFD permanece inconclusivo. Alguns pesquisadores não encontraram efeitos dependentes do local de coleta oral,45 enquanto outros atribuem isso a variações regionais na expressão de antígenos e na distribuição de células inflamatórias.46
- (ii)
Limitações técnicas: a preparação inadequada das lâminas causa resultados falso‐negativos, incluindo falhas na preservação do tecido durante o transporte, processamento tardio da amostra, espessura inadequada da seção, anticorpos fluorescentes de baixa qualidade ou proporções de diluição incorretas.6
- (iii)
Curso da doença: a dinâmica dos complexos imunes dependente do estágio leva a resultados falso‐negativos no teste de IFD: deposição insuficiente nas fases iniciais/de remissão, redução transitória de autoanticorpos durante flutuações da doença ou destruição epidérmica no estágio avançado do PMM.41,47,48
- (iv)
Interferência do tratamento: imunossupressores (glicocorticoides ou imunomoduladores) suprimem a atividade das células imunes, reduzindo os níveis de autoanticorpos e, portanto, levando a resultados falso‐negativos na IFD.40,41,47,49
- (v)
Heterogeneidade dos pacientes/doença: níveis subótimos de autoanticorpos no soro dos pacientes e doença localizada (p. ex., envolvimento ocular isolado) podem contribuir para resultados falso‐negativos no teste de IFD.50,51
Portanto, recomenda‐se a repetição da biopsia para casos inicialmente negativos a fim de melhorar a detecção.21,52
Embora o presente protocolo tenha priorizado a IFD, a histopatologia e ELISA BP180/BP230, os autores reconhecem a recomendação das diretrizes para imunofluorescência indireta (IFI) utilizando a técnica salt‐split skin e teste antilaminina 332 em cenários específicos.6 Isso é particularmente relevante, visto que 19 casos de PMM sorologicamente negativos foram confirmados por IFD e histopatologia na presente coorte. A incorporação de IFI em salt‐split skin e teste antilaminina 332 poderia potencialmente aumentar a sensibilidade sorológica. Protocolos futuros devem integrar esses procedimentos, conforme as diretrizes S3, para otimizar a estratificação de risco.53–56
Este estudo apresenta diversas limitações inerentes que merecem reconhecimento. Primeiro, o desenho retrospectivo de centro único limita inerentemente a generalização dos resultados, particularmente em relação às análises de correlação, avaliações de eficácia do tratamento e dados de seguimento em longo prazo. Além disso, o tamanho amostral limitado de casos com IFD negativos (n=8) impediu análises estatísticas mais robustas, restringindo, assim, a investigação detalhada de potenciais fatores de confusão, como a seleção do local da biopsia ou influências terapêuticas.
ConclusãoA IFD é ferramenta altamente específica e valiosa para o diagnóstico de PMM, com desempenho ideal quando integrada à avaliação histopatológica. Os presentes achados corroboram as diretrizes atuais que recomendam a IFD como método diagnóstico de primeira linha em casos clinicamente suspeitos. Estudos multicêntricos futuros com coortes maiores são necessários para explorar o impacto dos regimes de tratamento e da progressão da doença nos resultados da IFD.
Suporte financeiroNenhum.
Contribuição dos autoresHongjie Jiang: Obtenção dos dados, ou análise e interpretação dos dados; análise estatística; elaboração e redação do manuscrito ou revisão crítica de conteúdo intelectual importante; obtenção, análise e interpretação dos dados; revisão crítica da literatura; aprovação da versão final do manuscrito.
Pan Wei: Elaboração e redação do manuscrito ou revisão crítica de conteúdo intelectual importante; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica da literatura; aprovação da versão final do manuscrito.
Zhixiu Xu: Obtenção dos dados, ou análise e interpretação dos dados; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados.
Yan Chen: Análise estatística; participação efetiva na orientação da pesquisa.
Binbin Li: Concepção e planejamento do estudo; análise estatística; elaboração e redação do manuscrito ou revisão crítica de conteúdo intelectual importante; obtenção, análise e interpretação dos dados; participação efetiva na orientação da pesquisa; revisão crítica da literatura; aprovação da versão final do manuscrito.
Disponibilidade de dados de pesquisaTodo o conjunto de dados que dá suporte aos resultados deste estudo foi publicado no próprio artigo.
Conflito de interessesNenhum.
EditorAna Maria Roselino
Os autores agradecem ao Prof. Hong Hua e aos colegas do Departamento de Medicina Oral pelo apoio clínico e à Sociedade Brasileira de Dermatologia pelo financiamento da publicação deste artigo.
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