A detecção de mosaicismo em doenças humanas pode ser um desafio, pois o número de células de mosaico no tecido alvo pode ser pequeno. Além disso, os melanócitos em mosaico provavelmente estariam ausentes nas lesões de VS existentes, pois a perda de melanócitos é a causa do vitiligo. Portanto, métodos de alta resolução ao nível de célula única podem ser necessários para detectar populações de células sub‐representadas.24 Para detectar possíveis células em mosaico, seria necessário avaliar o tecido obtido de regiões hipocrômicas da pele de indivíduos no estágio inicial do VS (fig. 1A). Uma vantagem de estudar a hipótese do mosaicismo no VS é a possibilidade de usar controles internos, uma vez que o VS geralmente é restrito a um segmento unilateral: se a mutação de novo ocorreu durante a diferenciação da pele em um segmento, a pele saudável contralateral poderia ser usada para estabelecer o perfil “normal” do melanócito (fig. 1A). Essa estratégia permitiria controlar os efeitos de confusão causados pela variabilidade interindividual ao combinar vários casos de VS.25

Figura 1.

Desenho experimental para testar a hipótese do mosaicismo no vitiligo segmentar. (A) Representação de paciente com vitiligo segmentar. Áreas hipocrômicas destacadas com um círculo vermelho completo seriam avaliadas quanto à presença de melanócitos em mosaico. Amostra de pele contralateral marcada com círculo pontilhado seria usada como controle interno. (B) Composição cutânea para pele contralateral e hipocrômica. A pele hipocrômica inclui melanócitos em mosaico residuais. (C) Técnica de bolhas de sucção subepidérmica de pele normal e afetada. A tripsinização do teto da bolha possibilita o desprendimento de queratinócitos e melanócitos, que podem estar junto com células imunoinfiltradas, utilizadas nos experimentos com células únicas. (D) Código de barras de célula única. O conjunto contendo a suspensão de células para a pele normal e afetada seria carregado no canal de célula única. Células individuais seriam incorporadas em gotículas de óleo e marcadas com esferas com código de barras exclusivos, o que possibilitaria a aplicação de diferentes conjuntos de abordagens de célula única, incluindo scWGS, scRNA e scATAC. (E) Cluster de células utilizando dados ômicos. A análise de clusters agruparia células que compartilham estados semelhantes e identificaria melanócitos em mosaico, bem como outros tipos de células incluídos no tecido da bolha.

(1,05MB).

Os melanócitos representam ∼2,8% da população de células na epiderme e existem aproximadamente 1.200 melanócitos por mm2 de pele, independentemente da etnia do indivíduo (fig. 1B).26 Para capturar um número representativo de melanócitos em mosaico viáveis para a análise de célula única, áreas hipocrômicas de VS ativo de início precoce precisariam ser identificadas utilizando a lâmpada de Wood. A amostragem de queratinócitos‐melanócitos dessas áreas pode ser realizada com uma técnica de enxertia epidérmica por bolhas de sucção com tripsinização subsequente do teto da bolha para destacar as células em suspensão (fig. 1C).27 Uma vantagem de coletar epiderme usando a bolha de sucção é a ampliação da área amostrada, o que aumenta a probabilidade de capturar melanócitos em mosaico viáveis remanescentes – é uma técnica quase sem cicatrizes, o que facilita a inclusão de pacientes.28 Para avaliar melanoblastos foliculares não capturados pelo método da bolha de sucção, a técnica por punch também pode ser utilizada. A biópsia por punch é mais invasiva do que a bolha, e a proporção geral de melanoblastos capturados seria pequena. No entanto, refinamentos metodológicos de análise de célula única podem permitir em um futuro próximo o estudo de populações de células menores.

Para avaliar a presença de melanócitos em mosaico, a seleção por amostragem celular ativada por fluorescência pode ser usada para separar a fração de melanócitos em tecido de bolhas ou melanoblastos em biópsias por punch. Em seguida, seria realizado o sequenciamento do genoma completo (WGS – whole genome sequencing) utilizando DNA extraído de melanócitos da pele hipocrômica e contralateral dos mesmos indivíduos. As variantes detectadas em tecidos contralaterais seriam utilizadas para excluir variantes germinativas. Algoritmos projetados para detectar células tumorais, como MuTect2,29 ou específicos para células em mosaico, como MosaicForecast30 e DeepMosaic,31 poderiam ser usados para detectar mutações somáticas. A limitação da abordagem em massa é a incapacidade de separar as células em mosaico dos melanócitos regulares e avaliar sua interação com outras células. Abordar essa limitação exigiria tecnologias de sequenciamento de célula única (sc – single‐cell) avaliando o perfil de sequência transcriptômica, epigenética ou de DNA de células individuais (fig. 1D).32 Os scWGS possibilitam a avaliação da variação estrutural, VNC e SNV em células individuais. Um método scWGS de alto rendimento desenvolvido para detectar mutações subclonais em câncer pode ser usado para testar a hipótese de mosaicismo de melanócitos.22 No VS, as células do mosaico compartilhariam um estado (isto é, variantes genéticas específicas) que poderia ser usado para agrupar células em clusters e definir a proporção e o tipo de variantes genéticas presentes nas células do mosaico (fig. 1E).33 O mosaicismo epigenético no VS pode ser testado usando abordagem multiômica com medidas transcriptômicas (scRNA) e de acessibilidade da cromatina (scATAC). Abordagens multiômicas estão sendo utilizadas atualmente para estudar um conjunto diversificado de doenças.34 Análises de scRNA e scATAC podem ser usadas para identificar células de mosaico por meio de semelhanças transcriptômicas e epigenômicas com ferramentas como Seurat,35 Monocle36 e Cicero.37 Abordagem semelhante de scRNA aplicada para estudar embriões humanos foi capaz de detectar com sucesso o mosaicismo.20 Uma vantagem da célula única em comparação com as abordagens em massa é a capacidade de estudar a relação entre as células presentes no tecido da bolha ou nas biópsias por punch. De fato, o estudo de scRNA de tecido de bolhas mostrou a recuperação de melanócitos de lesões de VNS.24 A aplicação da abordagem de célula única para estudar o VS pode testar a hipótese do mosaicismo ao avaliar o perfil imunológico local, como demonstrado para o VNS.24