A solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% (S) e a solução antisséptica (AS) de digluconato de clorexidina 10mg/mL foram adquiridas em uma farmácia local (Farmácia São Paulo ‐ Ribeirão Preto/SP). O soro de látex Hevea brasiliensis (SLX) foi obtido da empresa Pelenova Biotecnologia S/A (Distrito Industrial ‐ Ribeirão Preto/SP) e descrito por Mendonça.16 Resumidamente, o látex foi obtido da seringueira (Hevea brasiliensis) do clone RRhim 600. Ao látex natural foi adicionado hidróxido de amônio (2%) quando coletado, para que sua coagulação fosse evitada. Adicionou‐se uma solução de ácido acético a 2,2% (1:2 v/v) sob agitação suave. Em uma próxima etapa, separou‐se o soro puro da borracha e submeteu‐se a diálise e a liofilização. A purificação e a caracterização do soro foram feitas conforme previamente descrito por Mendonça,17 com eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Três frações principais foram obtidas e designadas como FrHB1, FrHB2 e FrHB3. Além disso, de acordo com o fabricante do produto final (gel‐creme) usado em experimentos pré‐clínicos e também em uso clínico, para eliminar a proteína causadora do maior número de reações alérgicas, heveína e seus derivados, o processo de filtração tangencial foi feito para considerar apenas substâncias abaixo de 10 kDa. O soro de látex puro foi diluído em meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) em concentrações de 0,1% a 1% para o ensaio de viabilidade e de 0,00001% a 1% para o ensaio de migração/proliferação. Para experimentos in vivo usou‐se soro de látex em gel‐creme (Valeant Pharmaceuticals International Inc. ? São Paulo, SP, Brasil).

As células NIH‐3T3 (linhagem celular de fibroblastos de camundongo) foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC CRL‐1658, Manassas, Virgínia, EUA). Queratinócitos humanos foram isolados de fragmentos saudáveis de pele humana com o consentimento de pacientes submetidos à cirurgia plástica de mama ou abdome na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto ‐ processo 5606/2008.

Fibroblastos foram cultivados em meio de cultura DMEM alta glicose (4,5 g/L) (GIBCO --‐ Invitrogen Corporation ‐ Grand Island, NY) e queratinócitos em meio de cultura Defined Keratinocyte Medium (GIBCO ‐ Invitrogen Corporation ‐ Grand Island, NY, EUA) e foram suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1% de antibiótico e antimicótico (GIBCO ‐ Invitrogen Corporation ‐ Grand Island, NY, EUA), a 37°C, em atmosfera úmida e 5% de CO2.

A viabilidade dos fibroblastos NIH‐3T3 e dos queratinócitos humanos foi determinada pelo ensaio colorimétrico MTT de tetrazólio 3‐[4,5‐dimetiltiazol‐2‐il]‐2,5‐difenil.18 Fibroblastos e queratinócitos foram semeados em microplacas de 96 poços na concentração de 2×104 células/mL. As placas foram incubadas durante a noite para adesão celular. Após esse tempo, o sobrenadante foi aspirado e 200μL de soluções teste que continham soro de látex foram adicionados de acordo com as seguintes concentrações: apenas meio de cultura basal (controle positivo), 0,1% e 1% (concentração de SLX foram diluídos em meio de cultura) e 50%/50% de meio de cultura e dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO como controle negativo). As placas foram incubadas por 24 e 48 horas. Após a incubação, o sobrenadante foi aspirado e as células foram lavadas com solução tampão fosfato‐salino (PBS). Em seguida, 20μL da solução estoque de MTT (Sigma‐Aldrich Co. LLC) (5mg/mL em PBS) com 180μL de meio de cultura DMEM (sem vermelho de fenol) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas sob as mesmas condições por 3 horas. Depois, a solução de MTT foi removida e 200μl de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A absorbância foi lida em 570nm. O experimento foi feito em triplicata, consideraram‐se três experimentos independentes. Os resultados foram expressos como uma porcentagem da viabilidade celular.18–20

Para analisar as propriedades do soro de látex (SLX) que estimulam a migração/proliferação de queratinócitos, foi feito um ensaio de “arranhão” (scratch assay) in vitro.21,22 Os queratinócitos humanos foram semeados em placas de cultura de 24 poços a uma concentração de 3×104 células/poço e foram cultivados com meio que continha 10% de soro bovino fetal até atingir uma confluência de aproximadamente 80%. Em seguida, um arranhão linear, que imitava uma ferida artificial, foi criado na monocamada celular com uma ponteira de plástico de 200μL. O meio foi removido e as células foram lavadas com PBS. Meio com 50% de DMSO (controlo negativo), meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (basal), definido para 0 no eixo X e meio que continha concentrações de SLX de 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% e 0,00001% foram adicionados em três poços por grupo e foram incubados por 24 horas a 5% de CO2 a 37°C. Após 24 horas, os poços foram lavados com PBS e fixados com paraformaldeído 4% durante 15 minutos. As células foram lavadas mais uma vez e coradas com 4’,6‐diamino‐2‐fenil‐indole (DAPI) durante 5 minutos. Imagens de áreas foram adquiridas com um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera (Carl Zeiss®, Oberkochen, GE). A proliferação/migração de células para a região com o arranhão foi quantificada com o programa ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Os resultados foram expressos em porcentagem de células que migraram e/ou proliferaram para a área após o tratamento com SLX, em comparação com o número de células que migraram e/ou proliferaram no grupo controle. Os experimentos também foram feitos em triplicata, consideraram‐se três experimentos independentes.

Os estudos foram conduzidos e aprovados pelos princípios éticos em pesquisa animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea) e aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (Cetea) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, registro n° 072/2012.

Foram alojados 72 ratos Wistar machos adultos (Rattus norvegicus, 180‐200g) do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto por sete dias antes do experimento. Durante todo o período experimental, os ratos foram mantidos em gaiolas individuais de policarbonato a uma temperatura constante (23±2°C) e umidade (55%) sob um ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Os animais tiveram livre acesso a uma dieta padrão e água.

Os ratos foram anestesiados intraperitonealmente com cetamina (70mg/kg) e xilazina (12mg/kg). A região do dorso de cada rato foi tricotomizada e feita assepsia com álcool 70%. Dermoabrasor LB‐100 (Beltec Indústria e Comércio de Equipamentos Odontológicos, Araraquara/SP) foi usado para fazer as escoriações com uma lixa diamantada RH14633 (RHOSSE Instrumentos Cirúrgicos, Ribeirão Preto/SP) no dorso do animal, uma lesão cutânea de aproximadamente 2cm2. A administração intraperitoneal de dipirona, 50mg/kg de peso corporal, foi diluída em solução salina e administrada duas vezes ao dia (12/12 horas) durante as primeiras 48 horas para prevenir a dor. Em seguida, os animais foram colocados em gaiolas individuais até o fim do experimento. Os animais foram divididos em três grupos, com 24 ratos cada, e tratados diariamente com soro de látex em gel‐cream (SLX 1%), solução antisséptica (AS) padrão (digluconato de clorexidina 10mg/mL) (veículo) como controle positivo e solução salina (S) por 10 dias, sem curativo oclusivo.

As imagens das feridas foram obtidas nos dias 0, 2, 7 e 10 após o tratamento com uma câmera digital de 14 megapixels (Kodak EasyShare M575) fixada em um suporte padronizado para imagens, apresentava uma régua como referência de medição; o cálculo do índice de cicatrização das escoriações (ICE) foi feito pela seguinte fórmula: [(área inicial−área final)/área inicial], conforme descrito e feito por Leite23 para feridas cutâneas.

Oito animais de cada grupo foram eutanasiados com uma dose excessiva de anestésico nos dias 2, 7 e 10. Em cada dia de acompanhamento, um fragmento foi retirado com uma tesoura. Uma metade da amostra foi embebida em solução de formaldeído tamponado a 10% (v/v) para estudo histológico (hematoxilina‐eosina); a outra metade da amostra foi condicionada a−80°C para ensaios bioquímicos.

As biópsias foram embebidas em parafina, conforme descrito anteriormente por Andrade.24 Um microscópio óptico Leica DM 4000B equipado com uma câmera Leica DFC 280 (Leica Microsystems®, Alemanha) foi usado para capturar as imagens histológicas com aumento de 400×por meio do programa Leica Application Suite (LAS) versão 3.2.0. Foi feita uma seção de corte completa das áreas lesionadas por animal (seção transversal) e foram fotografadas três imagens de cada lâmina e três medidas foram feitas por cada imagem. Para as medições da crosta e da epiderme foram feitas de uma ponta a outra com base principalmente no infiltrado inflamatório neutrofílico na borda da epiderme. A imagem foi aberta e uma linha foi desenhada a partir da camada granular da epiderme até a transição com a derme (espessura da epiderme) e espessura da crosta. No fim da medição, o programa forneceu a distância em μm.25

As biópsias coletadas foram acondicionadas em tubos plásticos de 2mL com 200μL de tampão NaCl 0,1M, NaPO4 0,02M, NaEDTA 0,05M pH 4,7 e permaneceram a−70°C até o uso. Os fragmentos foram homogeneizados por um homogeneizador Tissue Omni (TH) (Kennesaw, GA, EUA) a 13.000rpm. Após a centrifugação, ressuspendeu‐se em tampão NaPO4 (Ph 5,4) que continha 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HTAB). Em seguida, 5μL do sobrenadante das amostras foram colocados em uma placa de 96 poços para o ensaio. Uma curva‐padrão de neutrófilos foi obtida com neutrófilos isolados de camundongos após 6 horas de inoculação de 0,25mL de carragenina a 1% (Sigma Aldrich) na cavidade peritoneal. Vinte e cinco microlitros de TMB – “3,3’, 5,5’‐tetrametilbenzidina” (Sigma Chemical Company ? St. Louis, MO, EUA) foram adicionados a cada poço da placa (amostras e curva‐padrão de neutrófilos), seguido por 100μL de H2O2. A reação foi então interrompida com ácido sulfúrico 4M e lida em um leitor de placas a 450nm.26

Os dados foram expressos com o valor médio±EPM (erro‐padrão das médias). A análise estatística foi feita com o programa GraphPad (San Diego, CA, 176 USA). As variações estatísticas entre os grupos foram determinadas com análise one‐way Anova (variância para múltiplas comparações), seguida de um pós‐teste Bonferroni. Valores de p <0,05 foram considerados significativos.

Inicialmente, a viabilidade in vitro de SLX foi avaliada pelo método colorimétrico de MTT com a linhagem de fibroblastos NIH‐3T3 e queratinócitos humanos. Após 24 horas de incubação, SLX 1% e 0,1% não apresentaram efeitos citotóxicos contra fibroblastos em relação ao controle basal (apenas meio de cultura celular, considerando‐se 100% de viabilidade), apresentaram viabilidade de 109% e 105%, respectivamente (fig. 1A). Resultados semelhantes foram observados com queratinócitos humanos que exibiram 106% e 95% de células viáveis após exposição à SLX 1% e 0,1%, respectivamente (fig. 1B).

Figura 1.

Viabilidade celular. Porcentagem de viabilidade de fibroblastos NIH‐3T3 (A‐C) e queratinócitos humanos (B‐D) em cultura com 24 horas (A‐B) e 48 horas (C‐D) em relação à cultura controle (correspondendo a 100% de células viáveis) pelo MTT método, distribuído em concentrações de soro de látex: 1% e 0,1%. Valores representam médias±EPM de resultados em triplicata. Teste estatístico Anova, pós‐teste Bonferroni.

* Diferença significativa (p <0,05) em relação ao controle positivo.

# Diferença significativa (p <0,05) em relação ao controle negativo.

(0.54MB).

Após 48 horas de incubação, resultados semelhantes foram observados. Os fibroblastos mostraram porcentagens de viabilidade de 91% e 94% para 1% e 0,1% de SLX, respectivamente (fig. 1C), e 119% e 111% para queratinócitos, respectivamente (fig. 1D).

Para avaliar a migração/proliferação celular in vitro, o ensaio de arranhão foi feito com queratinócitos humanos. Após 24 horas, o SLX estimulou a proliferação/migração de queratinócitos humanos numa relação dose dependente. Os maiores efeitos estimuladores foram observados com concentrações de 0,1% e 0,01% e aumento do número de células em até 70%. O grupo SLX a 1% exibiu efeito antiproliferativo (p <0,05) em comparação com o número de células no grupo controle (figs. 2 A e B).

Figura 2.

Migração celular. (A), imagem microscópica fluorescente (DAPI) do ensaio de “arranhão” com queratinócitos humanos. A migração/proliferação celular no ensaio de “arranhão” foi observada em resposta a uma “lesão artificial” tratada com diferentes concentrações de soro de látex. (B), porcentagem de migração/proliferação de queratinócitos humanos em relação ao meio de cultura basal, definido como 0 no eixo X, distribuído em várias concentrações do soro do látex (SLX) tratado por 24 horas em cultura. Valores representam médias±EPM de resultados em triplicado. Teste estatístico Anova, pós‐teste Bonferroni.

*Corresponde à diferença significativa (p <0,05) entre os grupos (aumento: 50×).

(0.42MB).

O processo de reepitelização foi avaliado por meio do índice de cicatrização das escoriações. No segundo dia de acompanhamento, todos os grupos estudados apresentaram reepitelização semelhante (p >0,05). No entanto, no sétimo dia, o grupo SLX apresentou maior taxa de reepitelização em relação aos grupos S e AS (p <0,05). No décimo dia, as escoriações apresentaram‐se quase reepitelizadas, alcançaram médias percentuais de reepitelização de 83% no grupo S, 88% no AS, e 99% no grupo SLX (p >0,05) (figs. 3 A e B).

Figura 3.

Reepitelização. (A), seguimento clínico das escoriações cutâneas; (B), quantificação da reepitelização (pelo índice de cicatrização das escoriações) tratadas com S, AS e SLX. Teste estatístico Anova, pós‐teste Bonferroni.

*Corresponde à diferença significativa (p <0,05) entre os grupos.

(0.16MB).

A coloração com hematoxilina e eosina foi usada para análise histológica. A figura 4 apresenta imagens representativas (foram escolhidas as imagens com menores e maiores quantidades de crosta e epiderme) durante diferentes aspectos da reepitelização dos grupos no décimo dia. O grupo SLX destacou a menor quantidade de crosta e uma epiderme mais espessa com maior número de camadas de queratinócitos, em contraste com outros grupos que ainda apresentavam uma crosta mais espessa e uma epiderme mais fina.

Figura 4.

Fotomicrografia das áreas escoriadas. Fotomicrografia das áreas escoriadas tratadas topicamente com S, AS e SLX no décimo dia de seguimento; as amostras foram coradas com hematoxilina‐eosina (HE), destacam‐se a quantidade de crosta e espessura da epiderme com uma fotomicrografia melhor e pior em cada grupo e tratamento. As setas vermelhas indicam a espessura da epiderme (aumento: 100×).

(0.63MB).

Em relação à espessura da crosta, o grupo SLX apresentou espessura menor do que a do grupo S. O grupo AS também apresentou menor espessura de crosta que o grupo S (p <0,05) (fig. 5A). O grupo SLX apresentou a epiderme mais espessa entre os grupos (p <0,05) (fig. 5B).

Figura 5.

Distribuição da média da espessura (μm) da crosta da epiderme. (A), distribuição da média da espessura (μm) da crosta e (B), distribuição da média da espessura (μm) da epiderme dos grupos tratados com S, AS e SLX no décimo dia do segmento. Valores representam médias±EPM. Teste estatístico Anova, pós‐teste Bonferroni.

*Corresponde à diferença significativa (p <0,05) entre os grupos.

(0.09MB).

A avaliação do infiltrado neutrofílico durante o processo inflamatório foi estimada pelo conteúdo de mieloperoxidase (MPO) nas biópsias (n=8 por grupo/dia). Alta concentração de MPO foi observada em todos os grupos no segundo dia. Após sete dias pós‐lesão, uma diminuição no conteúdo de MPO foi observada em todos os grupos, mesmo em SLX e AS (p <0,05). No décimo dia, mostrou o mesmo perfil do sétimo dia. Não houve diferença significativa entre os grupos nos tempos estudados (p >0,05) (fig. 6).

Figura 6.

Quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO). Quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO) de escoriações cutâneas tratadas topicamente com S, AS e SLX para o segundo, sétimo e décimo dias de seguimento. Valores representam médias±EPM. Teste estatístico ANOVA, pós‐teste Bonferroni.

*Corresponde à diferença significativa (p <0,05) entre os dias no mesmo grupo.

(0.07MB).