Dermatite atópica (DA) é doença crônica, multifatorial, cujo fenótipo clínico resulta da interação de fatores genéticos e ambientais.1 A desregulação imunológica e a integridade da barreira cutânea determinam sua gravidade, predispondo a infecções e permeabilidade a antígenos.2 É motivo comum de atendimento dermatológico, principalmente na infância (< 12 anos), representando 25,8% das consultas dermatológicas.3

O gene que codifica a filagrina (FLG) é altamente polimórfico, na região do complexo de diferenciação epidérmica (1q21.3), codificando as proteínas mais importantes envolvidas na homeostase da barreira cutânea. FLG é o principal fator genético associado à DA, e seu éxon‐3 transcreve a maior parte da proteína profilagrina. Alterações da barreira cutânea estão presentes em pacientes com DA sem alterações do gene FLG; entretanto, a presença de variantes que levam à perda de função foram associadas a fenótipos clínicos como doença persistente de início precoce, asma e sensibilização alérgica.1,4 Intensa disparidade étnica na frequência de variantes que levam à perda de função do gene FLG associadas à DA tem sido observada.5

Mais de 60 variantes do gene FLG que levam à perda de função do gene FLG foram identificadas em associação com DA; as mais comuns entre os europeus são c.1537C>T:R501X e 2282del4:S761Cfs*36 e, entre os africanos subsaarianos, c.9947C>G:S3316*. Poucos estudos foram realizados em pacientes latino‐americanos com DA. Nosso objetivo foi avaliar a frequência de variantes do gene FLG (no éxon‐3) entre pacientes com DA para comparar populações brasileiras e internacionais e explorar suas características clínicas.

Foi realizado estudo transversal no ambulatório de dermatologia (FMABC; Santo André, São Paulo). Oitenta pacientes com DA (critérios de Hanifin e Rajka) de ambos os sexos foram incluídos e examinados por dermatologista experiente para avaliar a gravidade da doença (SCORAD, EASI) e coletar amostras de sangue venoso para análise laboratorial e da mucosa oral para análise genética. Os participantes/responsáveis assinaram termo de consentimento livre e esclarecido.

A coleta para análise genética foi realizada por swab da mucosa da região bucinadora dos pacientes e colocado num tubo de ensaio estéril (Oragene Collector OG‐500®, DNA Genotek Inc., Kanata, Ontario), que foi submetido ao sequenciamento pelo método de Sanger.

A extração de DNA foi realizada utilizando precipitação com etanol, e um reagente prepIT 2P fornecido pelo kit Oragene.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a análise de seu sequenciamento foram realizadas com foco no éxon‐3 para identificar as variantes genéticas mais comuns – c.1537C>T:R501X (rs61816761) e c.2282del4:S761Cfs*36 (rs558269137) utilizando primers validados da Thermo Fischer Scientific® (Applied Biosystems, Foster City, CA), (Hs00274028 forward: 5’CTA ACA CTG GAT CCC TGG TTC CTA 3’ e reverse 5’ CTG AGA CAG CAG AGC CAC CAA GA 3’ e Hs00395823, forward: 5’ CAG ACC TAT CTA CCG ATT GCT CGT 3’ e reverse: 5’ AAA TCA GGC ACTCGT CAC ACA CAG AA 3’). Essa estratégia possibilitou investigar outras variantes em áreas vizinhas ao loci alvo, mas não cobriu toda a região de codificação do éxon‐3 (fig. 1). Os produtos de PCR foram purificados com esferas de DNA (Agencourt – AMPure XP‐Beckman Coulter, Brea, CA). As amostras purificadas juntamente com 10 μL desses primers foram utilizadas para a reação de sequenciamento. O ciclo de sequenciamento foi realizado com o kit Big Dye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific). Os produtos de sequenciamento foram submetidos à eletroforese capilar no ABI 3500 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os dados de sequenciamento foram avaliados com o software Seq A(14) – Applied Biosystems, Foster City, CA. O PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer) v1.1 foi usado para prever se uma variação de sequência de proteína causada por uma substituição missense afetaria a função da proteína (disponível em https://provean.jcvi.org/index.php).

Figura 1.

Gene FLG incluindo distribuição dos éxons, tamanho dos éxons, íntrons, indicação de região de codificação da profilagrina, posição dos primers e eletroferogramas das três mais frequentes variantes patogênicas encontradas em nossa amostra.

(0.24MB).

A prevalência de cada variante identificada foi comparada ao banco de dados público brasileiro de variantes genômicas (ABraOm; hg38 – https://abraom.ib.usp.br/) com 1.171 amostras da população da mesma região e um banco de dados internacional (genomAD; v3.1.2 – https://gnomad.broadinstitute.org/) com 76.156 indivíduos não aparentados de diferentes etnias. A significância estatística foi definida como p ≤ 0,001.6

Dados demográficos principais, gravidade clínica, eosinofilia e níveis de IgE estão na tabela 1. A maioria dos pacientes apresentava DA moderada e grave (79%), níveis elevados de IgE (98%) e eosinofilia (68%).

Os resultados da análise genética da amostra de DA e a comparação com os dois controles populacionais estão na tabela 2. Vinte e seis variantes genéticas do éxon‐3 do gene FLG foram detectadas em 60 pacientes (75%; 95%IC: 65%–85%). Homozigose e heterozigose composta não foram identificadas.

Variantes do gene FLG com perda de função da filagrina foram observadas em oito pacientes com DA (10%; 95% IC 3%–17%). Duas variantes prevalentes no mundo (c.1537C>T:R501X e 2282delCAGT:S761Cfs*36) foram observadas em seis pacientes (7,5%). Outra variante patogênica (c.2512C>T:R826X) foi identificada em dois pacientes (2,5%). Essas três variantes patogênicas foram mais prevalentes na amostra de DA que nos controles brasileiros (p<0,001). A variante 2282delCAGT:S761Cfs*36 é comum em europeus, enquanto c.2512C>T:R826X é comum entre afro‐americanos.

Foram encontradas oito variantes sinônimas do gene FLG, quatro delas amplamente distribuídas no Brasil e no mundo. Entretanto, quatro delas (c.1665T>G:rs152285733, c.1737A>C: sinônimo, c.1521G>A: sinônimo e c.1800T>C: sinônimo) foram observadas como mais comuns na amostra de DA do que no mundo (p <0,001). A variante c.1476T>C: sinônimo, rara na população brasileira e internacional (p <0,001), é comum entre afro‐americanos. O sinônimo c.2544T>C, considerado comum entre pacientes com DA e controles regionais, é extremamente raro no mundo (p <0,001).

Catorze variantes missense foram detectadas; duas delas (c.1712A>G:H559R, c.1777A>T:T581S) foram mais comuns entre pacientes com DA que controles regionais e internacionais (p <0,001).

Nenhuma variante do gene FLG foi associada à gravidade clínica da DA, eosinofilia ou IgE sérica elevada (p> 0,1).

Esses resultados reforçam o alto polimorfismo do éxon‐3 do gene FLG e sua associação étnica, dificultando a generalização dos resultados genômicos em relação aos fenótipos de DA, especialmente em populações altamente miscigenadas.5,7,8

Segundo a literatura, variantes nulas eram esperadas em 14%–42% dos pacientes com DA, e dessas, 20 encontradas no éxon‐3. Além disso, variações foram relatadas do gene FLG entre pacientes com DA de diferentes etnias.8

A população brasileira é multirracial após 500 anos de miscigenação entre indivíduos da Europa Ocidental, África e Ameríndia.9 As variantes c.2512C>T:R826X e 2282delCAGT:S761Cfs*36 nos pacientes com DA corroboram essas ancestralidades, embora a variante c.2544T>C: sinônimo seja uma característica dessa região.

Considerando associação epidemiológica com o desenvolvimento da doença, variantes do gene FLG perse não explicam completamente a variação na gravidade da DA, eosinofilia ou níveis elevados de IgE, reforçando os aspectos multifatoriais da doença.1,8,10

Por fim, identificamos variantes nulas do gene FLG (no éxon‐3) (c.1537C>T:501X, c.2282del4:S761Cfs*36 e c.2512C>T:R826X) em 10% dos pacientes brasileiros com DA, mesmo sem associação com as principais características clínicas da DA.